北京哪里看白癜风看的好 https://wapjbk.39.net/yiyuanfengcai/hj_bjzkbdfyy/

大脑是身体中灌注最高的器官之一，满足其较高的代谢需求，大脑功能状态很大程度上取决于脑血管系统的健康，脑血管功能障碍会导致中风、先天性神经系统疾病和与年龄相关的神经退行性疾病。脑血管系统形成一道特殊的血脑屏障结构介导血液和大脑之间溶质的选择性透过，血脑屏障是维持神经元功能状态所必需的，但阻碍了几乎所有脑部疾病的药物治疗，因此有很多研究试图发现人类血脑屏障上可以增强药物输送的靶标。

脑血管的特性源于相互作用的复杂细胞群落，这篇题目为AhumanbrainvascularatlasrevealsdiversemediatorsofAlzheimer’srisk发表在Nature期刊上的研究对人脑血管系统的单细胞图谱进行了报道，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞(SMC)和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等；它们在大脑不同区域存在差异并沿动静脉梯度变化，沿此梯度的细胞异质性组成产生功能分段的循环、代谢和渗透能力差异，揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，这将有助于我们了解人类大脑健康的基础、疾病机制和治疗靶点发现。

脑血管横切面示意图

人类样本分组

9名阿尔茨海默病（AD）患者

8名无认知障碍（NC）个体

人类样本取样部位

所有个体的海马体组织（Hippocampus）

分组各4名个体取额上回皮质组织（Superiorfrontalcortex）

小鼠样本

AD模型雄性小鼠：Thy1-hAPPLon,Swemalemice

同窝幼仔的野生型对照小鼠：littermatewild-typecontrolmice

独创VINE-seq方法进行脑血管单细胞核研究

从脑微血管中提取细胞核具有挑战性，从血管基底膜中释放细胞核经常导致细胞核受损严重，本研究成功发明了一种用于血管分离和细胞核提取的VINE-seq，该方法结合了脾细胞分离方案、蔗糖梯度离心和FACS分选等方法，获得了高质量的细胞核和数据，具体方法请详见原文methods，流程示意如下：

图1脑血管采用VINE-seq细胞抽核方法流程图

人脑血管系统细胞类型

共计,个单核转录组，得到15种主要细胞类型，包括所有已知的血管和血管周围细胞类型（图2），主要细胞类型有：

内皮细胞（动脉、毛细血管和静脉）

Endothelialcells

(arterial,capillary

andvenous)

平滑肌细胞

SMC

周细胞

Pericytes

星形胶质细胞

Astrocytes

小胶质细胞

Microglia

巨噬细胞

Macrophages

T淋巴细胞

Tcells

血管周围成纤维细胞

PerivascularFibroblasts

脑膜成纤维细胞MeningealFibroblasts

图2人类脑血管细胞图谱

通过经典markergenes鉴定出CD8cytotoxicT细胞和CD4T细胞，并且在巨噬细胞和小胶质细胞之间发现了个差异表达基因，可以作为区分两种细胞类型的参考基因（图3）。星形胶质细胞转录异质性在不同脑区之间明显。此外，海马组织中的内皮细胞比皮层中内皮细胞表现出更严重的基线炎症，表现出更高水平的干扰素-γ（IFNγ）信号（图2d）,这种炎症信号可能会抑制海马神经发生，加速的海马周细胞的消失，为海马血管系统的脆弱性和功能障碍提供了分子依据，在阿兹海默病中，海马体是首先受到损伤的区域。

图3小胶质细胞和巨噬细胞的差异表达基因

通过比较人和小鼠两个物种在内皮细胞和周细胞之间的差异，BEC、小胶质细胞和周细胞都表现出较大的物种间差异（图4e），在脑内皮细胞(BEC)和周细胞发现了数百个物种富集表达的基因，特别是发现了血管溶质转运蛋白如γ-氨基丁酸(GABA)转运蛋白（SLC6A12编码）有明显的物种间表达水平差异（图4），表明物种之间脑代谢活动存在显著区别。

图4人和小鼠脑血管细胞组成差异

内皮细胞

我们沿着人脑脉管系统的动、静脉轴表征内皮细胞，36,个BEC细胞聚集成动脉段、毛细血管段和静脉段，呈现分区段的规律（图5a），标记基因为：动脉VEGFC和ALPL，毛细管MFSD2A和SLC7A5，和静脉IL1R1和NR2F2。常规分群之外的一个小群（个细胞，约0.1%），该细胞群表达Tipcells特征基因（PLAUR和LAMB1）以及热休克蛋白的特征基因。对BEC细胞进行拟时分析发现动脉和静脉标志物在两端达到峰值，毛细血管标志物介于两者之间（图5b），我们使用个显著变化的基因对内皮细胞核进行无偏排序，观察到7种逐渐变化的基因表达模式，分别代表动脉、毛细血管或静脉标志物及其组合（图5c）。这样逐渐分区连续统一体模式在小鼠已有报道描述，因此，我们想知道在小鼠中建立的分区标记是否在人类中保守，事实上，我们在每个血管段中观察到大量标记物在物种之间失去了特异性（图5d）。例如，凝血基因-血管性血友病因子(VWF)主要在小鼠静脉内皮细胞中表达。然而，VWF在整个人类脑血管系统中表达，即使在小直径毛细血管中也是如此（图5d，e）。

图5人类脑血管内皮细胞组成特征分析

壁细胞

我们将34,个壁细胞聚集成动脉平滑肌细胞(aSMC)、小动脉SMC(aaSMC)和两个周细胞亚群（图6a、6b），其中一个周细胞亚群表达小分子跨膜转运相关基因，称之为T周细胞，另一个亚群表达细胞外基质(ECM)相关基因，称之为M-周细胞；M-周细胞可能导致小血管疾病，脑血管ECM的扰动可能是CADASIL（大脑常染色体显性遗传动脉病伴皮质下梗死和白质脑病）、CARASIL（常染色体隐性遗传性脑动脉病及动脉硬化伴皮质下梗死及白质脑病）和胶原蛋白IV缺乏症等疾病发生的重要原因。此外，人类T周细胞表达转运蛋白，如GABA转运蛋白SLC6A1（与癫痫有关）和谷氨酸转运蛋白SLC1A3。为了研究人类壁细胞的分区特征，我们使用个显著变异基因进行拟时分析，并观察到aSMC标记在一端，其次是aaSMC，而另一端的周细胞。这与在小鼠中描述的Reca凹陷模式以及人类BEC中的逐渐分区模式不同，人类壁细胞在SMC和周细胞之间表现出突然的基因表达转变（图6c）。为了确定T和M周细胞的排序（图3c）是否反映了解剖动静脉顺序，映射到小鼠壁细胞标记发现它们在小鼠毛细血管周细胞与静脉壁细胞的表达中没有差异（图6d），这表明人类T周细胞和M周细胞不按动静脉节段分离。

图6人类大脑壁细胞组成特征分析

这些数据表明人类周细胞转录更多地通过功能特化而不是动静脉位置区分。虽然aSMC和aaSMC分别位于动脉和小动脉血管上，但T周细胞和M周细胞沿毛细血管和静脉脉管系统混合存在。与BEC一样，我们发现只有小鼠SMC和周细胞少数top标记物在人类中有预测价值（图6e）。因为由分区标记基因编码的蛋白质在确定的动静脉位置执行各种关键功能，物种特异性内皮细胞和壁细胞的差异可能反映了脑血管特性的根本差异。

成纤维细胞

根据小鼠研究报道的细胞注释结果，我们观察到成纤维细胞来自人脑血管和脑膜屏障两个位置（图7a），脑膜淋巴管除了协同发挥血脑屏障的作用，在清除代谢废物和神经免疫监测中具有重要作用。成纤维细胞的转录特征根据位置分为血管与脑膜（图7a，b），通路富集分析揭示了其各自独特的成纤维细胞功能（图7b）：血管周围成纤维细胞显示出ECM结构成分或其修饰物或受体的丰富表达（例如ECM的TGFβ调节），而脑膜成纤维细胞则表达溶质运输蛋白。纤维化疤痕通常源于富含胶原蛋白I(COL1)的ECM的病理沉积，我们的工作表明人血管周围成纤维细胞是大脑中COL1的主要产生者，可能在脑损伤后形成纤维化疤痕。

图7成纤维细胞和通路富集分析

对成纤维细胞亚群进行差异基因（DEGs）分析，呈现出溶质流入和流出泵的极化表达规律：脑膜成纤维细胞特异性表达SLC流入溶质转运蛋白，而血管周围成纤维细胞仅表达ABC流出泵（图8d），并通过原位实验证实了这种极化表达（图8e）。血管周围成纤维细胞位于Virchow-Robin空间，因此像脑膜成纤维细胞一样，沐浴在脑脊液中。这种极化转运蛋白的协同回路表明成纤维细胞调节大脑和脑脊液之间的溶质交换。最后，与内皮细胞和壁细胞一样，血管周围成纤维细胞样细胞标志物因物种而异。这些数据共同揭示了人脑成纤维细胞多样性的特征，提示了其解剖学特化的分子基础和脑脊液溶质交换的协同回路。

图8脑膜成纤维和血管外周成纤维的转录特征差异

AD患者血管中细胞类型扰动

AD是一种神经退行性疾病，伴随着认知功能的进行性损害导致痴呆，损伤源于细胞组成和基因表达的复杂扰动，以前的研究确定了疾病相关神经胶质细胞亚群，但我们在AD患者中没有观察到新的血管细胞亚群（图9a），相比之下，我们发现脑血管中内皮细胞、SMC、周细胞和成纤维细胞样细胞的大量丢失（图9a、b）。因此，除了局灶性脑血管损伤外，血管损失可能广泛分布于动静脉轴。在周细胞中，参与ECM组织的M周细胞表现出选择易损性（图9b），为AD中报道的血脑屏障的结构破坏提供依据。然而，FACS和snRNA-seq方法可能并不总能产生可靠的细胞定量结果，因此，我们对海马组织进行染色，我们发现胶原蛋白IV+血管的面积或Hoechst+细胞核的总数没有显着差异，但随着AD的增加，胶原蛋白IV+血管内的Hoechst+细胞核数量显着减少（图5b）。

图9AD患者中脑血管细胞类型的扰动

我们接下来分析AD中细胞类型中个DEGs基因特异性变化（图9c），壁细胞表现出最强的基因差异变化，而其他细胞类型表现出基因抑制的特征，61-78%的DEGs被下调（图9c），大多数DEGs是细胞类型和分区特异性的（图10f），表明整个脉管系统对AD病理学的异质反应。值得注意的是，一些DEGs是与AD疾病GWAS分析相关的风险基因（图10g）。在通路水平，壁细胞和成纤维细胞中的DEGs与血管收缩失调和血流受损有关（图9d），这为在AD患者的磁共振成像扫描呈现脑低灌注现象提供了可能的机制解释。

图10AD患者细胞类型的DEGs特征分析

APOE4等位基因的携带者可能会在认知障碍之前表现出血脑屏障的加速分解，我们在APOE4携带者的内皮细胞中发现了明显的干扰素炎症（图9e）。接下来，我们将人类BEC中的ADDEGs与AD小鼠模型中的ADDEGs进行了比较，我们观察到人类AD和小鼠hAPPBECDEGs之间的重叠最小（图9f）。最后，我们评估了AD对大脑区域血管特化的影响，发现在AD中细胞密度和转录谱的区域差异在很大程度上被消除，表明大脑特定区域的血管功能受损。这些研究结果表明，AD患者表现出异质细胞类型、分区、区域和物种特异性的脆弱性和大脑血管系统的扰动需要单细胞方法进行分析。

ADGWAS基因在脑血脑细胞中表达分布

生物医学研究的一个主要目标是了解遗传变异如何导致疾病发生，GWAS分析已经发现了导致AD风险的基因（称为ADGWAS基因）。以前的研究表明小胶质细胞是表达ADGWAS基因的主要细胞类型，然而，他们在脑血管细胞中的潜在作用一直是被忽视的，我们分析了前45个ADGWAS风险基因，并且使用表达加权细胞类型富集(EWCE)计算了每个GWAS基因的细胞类型比例表达，有几个GWAS基因在人脑血管和血管周围细胞类型中强烈表达（图12a），前45个ADGWAS基因中至少有30个富集表达在人脑血管系统的细胞中，这表明AD疾病风险完全涉及血管和血管周围细胞。我们接下来想知道这些基因是否在小鼠和人类之间的不同细胞类型中表达，许多基因如APOE、CASS4、INPP5D和HLA-DRB1在小鼠中主要表达在小胶质细胞，但在人类中也出血管细胞中表达（图12c）。几乎所有在小鼠BEC中表达的topADGWAS基因在人类中都表现出更高的表达（图12d）。总之，这些数据表明AD风险基因从小鼠的小胶质细胞到人类的血管系统的进化转变。图12ADGWAS基因在人脑血管细胞中表达分布我们扩大到数百个用于ADGWAS基因和AD相关性状基因，依然可以观察到这些基因在血管周围细胞中的稳定表达。对于每个基因，我们分配了表达最强的细胞类型，发现BEC含有最多的ADGWAS基因，其次是小胶质细胞或巨噬细胞（图12e）。在BEC中，ADGWAS基因主要参与蛋白质内吞和转胞吞成分，例如受体和网格蛋白囊泡成分（图12d，e）。随着年龄的增长，BEC网格蛋白介导的转胞吞作用随着年龄的增长而下降，这表明衰老和风险基因会是增加AD风险的一种机制。与topGWAS基因一样，BEC和周细胞中AD相关基因的人类中表达增强（图12f）。

人脑血管-神经胶质细胞轴理论模型

AD与神经元和神经胶质细胞中的β-淀粉样蛋白代谢、胆固醇和脂质代谢、先天免疫和内吞途径有关。本研究极大拓展了所涉及的细胞类型，除了先天免疫外，通过BEC网格蛋白介导的内吞作用和适应性T细胞清除碎片。人类大脑、大脑活动和活动副产物（如β-淀粉样蛋白）的扩展需要增强清除机制和神经免疫监测，因此我们提出人类血管-小胶质细胞轴是通过共享蛋白质清除（BEC-小胶质细胞）和炎症途径（BEC-T细胞-小胶质细胞）理论模型，在这个模型中，小胶质细胞仍然是AD发病机制的一线参与者，比小鼠不同的是，人类血管和血管周围细胞也参与其中，例如，小胶质细胞清除功能可能会变得不堪重负，从而转移碎片到BEC。事实上，小胶质细胞耗竭会导致脑淀粉样血管病，但与小胶质细胞不同，血管细胞不能有效增殖，因此，血管持续暴露于β-淀粉样蛋白等碎片会引发细胞死亡、功能障碍以及血液和脑脊液流动受损。总之，人类发展出一个相互交织的小胶质细胞-血管轴，血管细胞通过内吞作用和炎症通路发挥辅助作用。

人脑血管-神经胶质细胞轴调控蛋白转运清除和炎症反应

文献来源

YangAC,VestRT,KernF,etal.AhumanbrainvascularatlasrevealsdiversemediatorsofAlzheimer’srisk[J].Nature,:1-8.

文章亮点总结

总结一

高质量的细胞或者细胞核的制备经常是单细胞测序技术的第一道“拦路虎”，本文对脑组织细胞核抽提技术进行了方法学的优化和改进，获得高质量细胞核和更多脑血管细胞类型，为中枢神经领域的单细胞研究工作者提供了宝贵的方法参考。

总结二

本文同时对比分析人和小鼠的脑血管细胞组成差异和基因表达特征规律，首次发现了从小鼠进化到人类的脑血管组成和功能转变，揭示了人类阿尔茨海默症发病的新机制，为疾病类细胞图谱文章增添新意。

总结三

过去大量的GWAS分析发现了很多AD疾病风险基因，大部分风险基因缺乏细胞功能层面的机制阐述，本文将GWAS分析结果与单细胞核转录组结果进行了联合，打通上下游的因果关系，提出了脑血管-神经胶质细胞共同调控AD发生和发展的理论模型。

德运康瑞基于多种商业化平台提供单细胞转录组、单细胞TCR/BCRV(D)J、单细胞ATAC以及单细胞多组学服务，积累+样本类型的细胞解离经验，针对神经类组织自主研发了单细胞核抽提方法，实现90%以上的抽提成功率；在苏州和厦门两地设立单细胞中心实验室，提供寄样和上门服务两种实验服务模式，从样本解离、细胞捕获、文库构建、测序分析、数据挖掘和个性化提供一站式全流程的综合服务解决方案，我们致力于打造高效、专业和让您放心满意的单细胞测序技术服务。

预览时标签不可点收录于合集#个上一篇下一篇