SteffenRosen,StefanTiefenbacher,MaryRobinson,MeiHuang,JaydeepSrimani,DonnieMackenzie,TerriChristianson,K.JohnPasi,SavitaRangarajan,EmilySymington,AdamGiermasz,GlennF.Pierce,BenjaminKim,StephenJ.Zoog,ChristianVettermann执行主编：王建祥中国医学科学院血医院翻译：牛思颖王琪江淼医院江苏省血液研究所审校：杨仁池中国医院（中国医学科学院血液学研究所）点评：杨仁池中国医院（中国医学科学院血液学研究所）全文关键点：

AAV5-FVIII-SQ的OS活性高于CS活性可能是由于AAV5-FVIII-SQ在体内凝血过程早期能更快速地生成FXa，从而导致两种检测之间的动力学差异。

使用CS试验，转基因产生的FVIII-SQ与重组FVIII-SQ的比活性（IU/mg）保持一致，而在OS试验中则存在差异。

摘要以腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）为基础的基因治疗可以恢复血友病A（hemophiliaA,HA）患者内源性因子VIII（factorVIII,FVIII）的表达。常用的策略是将B结构域缺失（B-domain-deleted,BDD）的FVIII基因转入AAV载体，例如载有FVIII-SQ序列的转基因药物valoctocogeneroxaparvovec（AAV5-FVIII-SQ）。然而令人惊讶的是，在一期凝血试验（one-stageclot,OS）中，转基因产物FVIII-SQ的活性比使用发色底物法（chromogenic-substrate,CS）测得的活性要高1.3-2.0倍，而重组FVIII-SQ产品的OS活性则低于CS活性。体内转基因产物和体外重组FVIII-SQ产品在CS检测中表现出相同的比活性（IU/mg），而用OS检测出的活性则出现了差异。通过各种检测试剂盒以及临床实验室中都观察到转基因FVIII-SQ的OS活性更高，这提示其中存在产生这种差异的内在分子特征。本研究中，我们对两例基因治疗的受试者开展了进一步实验，结果显示转基因产生的FVIII-SQ在凝血过程的早期加速了因子Xa和凝血酶的形成，这或许能解释OS和CS两种检测方法之中OS活性较高的原因，因为两者测得的活性存在动力学差异。尽管转基因FVIII-SQ凝血开始得更快，但总凝血酶水平没有受到影响。与关节出血的相关性分析表明OS和CS检测对于评估血友病和非血友病患者的FVIII活性水平仍然具有临床意义。在基因治疗的临床研究过程中，可以选择CS活性作为替代终点，以保守评估基因治疗的止血效果，并与重组FVIII-SQ产品进行比较。前言对于血友病A（hemophiliaA,HA）等遗传性出血性疾病而言，凝血因子活性测定是验证腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）介导的基因治疗成功的关键评价指标。血友病A由凝血因子VIII（factorVIII,FVIII）的遗传缺陷引起，AAV基因治疗旨在通过提供一种截短但功能完善的FVIII片段来弥补这一缺陷。例如，valoctocogeneroxaparvovec（AAV5-FVIII-SQ,BMN）中B结构域缺失（B-domain-deleted,BDD）的FVIII-SQ（补充图1）[1]。鉴于HA的单基因特性，血浆FVIII活性升高即可改善出血表型，并成为临床预后的预测标志。这对患者疗效管理和药物研发皆具意义，相对于患者主观提供的年出血率，将FVIII活性作为试验终点能够更客观地评估疗效。FVIII活性通过两种不同的方法进行测定：一期凝血试验（one-stageclot,OS）和发色底物法（chromogenic-substrate,CS）。然而，在首次对HA进行AAV基因治疗（试验-；NCT）后我们发现这两种检测方法产生了不一致的结果[1]。接受单剂量BMN基因治疗的HA患者的血浆FVIII活性在OS检测中比CS检测中平均高出约1.65倍。相反，重组BDD-FVIII产品的OS活性通常低于CS活性[2-6]。据先前报道某些纯化的FVIII标准品的OS活性高于CS活性（例如Mega2浓缩物），这可能是由于在冻干过程中FVIII的修饰加速了它的活化进程，从而导致OS活性提高了1.3倍[7,8]。此前我们在轻度HA患者中同样观察到更高的OS活性，这与某些特定位点的FVIII错义突变有关[9-11]；有报道显示，OS比CS检测的结果高1.67-4倍[12]。然而，由于AAV基因治疗衍生的FVIII-SQ未经体外加工，并且包含一段野生型共有氨基酸序列，这些先前的案例无法解释其活性的差异。随着AAV基因治疗在HA中得到预期的临床应用，我们试图更准确地测定转基因FVIII-SQ的活性。尽管检测误差不可避免，对比转基因FVIII和重组FVIII产品的活性仍十分重要，这在过去的30年中已成为HA治疗标准。为此我们应用了多种方法，包括涵盖不同OS和CS检测试剂盒的临床实验室研究，FVIII比活性（IU/mg）的测定，不同类型细胞中FVIII-SQ的产生，凝血途径的动力学特征，以及关节出血与FVIII活性之间的相关性分析。材料与方法血浆样品血浆来自于临床试验-（临床试验号：；EudraCT4--38；n=13）和临床试验-（NCT；7--19；n=22）中使用BMN治疗的受试者，上述临床试验由BioMarin赞助，实验遵循临床与实验室标准协会（ClinicalLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）指南（H21-A5，第28卷第5期）。来自健康献血者的血浆和作为质量控制的混合血浆（qualitycontrols,QCs）（CRYOcheck?PNP，ARP1，ARP2）均来自Precision，并根据需要以FVIII缓冲液（Chromogenix）稀释。混合的先天性乏FVIII血浆（HRF或GeorgeKing）用于ReFacto?质控。研究方案由当地伦理委员会批准，并获得参试患者知情同意。OSFVIII活性测定在BCS?XP分析仪（Siemens）上，将样本与免疫清除的乏FVIII缺陷血浆（Siemens）、APTT试剂（ActinFSL；Siemens）和CaCl2（Siemens）1:1混合，并用光学方法测量血栓形成时间。使用Precision提供的标准品CRYOcheckTMNRP分别准备7个浓度梯度的高（1.-0.IU/mL）和低（0.-0.IU/mL）浓度样本。以Tris/BSA缓冲液（50mMTris、mMNaCl和1%BSA）对高浓度样本以1:2稀释进行测试。以在乏FVIII血浆中制备的低浓度样本曲线作为基线。采用线性对数回归法一式两份进行校准。临床待测样本在3种稀释度下（在高浓度梯度和Tris/BSA缓冲液中为1:2、1:4和1:8；在低浓度梯度和乏FVIII血浆中为纯品、1:2和1:4）测试两次。除≤0.IU/mL的样品外，至少需要在平均值的±15%范围内进行两次稀释检测。发色底物法FVIII活性测定将样品与磷脂、FIXa、过量的FX和CaCl2在BCS?XP上混合，然后使用Coatest?SP4FVIII试剂盒（Chromogenix）添加FXa底物S-（ZD-Arg-Gly-Arg-pNA），并且在nm波长下测量颜色形成的速率（动力学模型）。使用CRYOcheck?NRP（Precision）标准品制备了8个高浓度梯度（1.-0.IU/mL）和8个低浓度梯度（0.-0.IU/mL）的校准曲线。在Coatest?FVIII缓冲液（1%BSA）中制备的高浓度曲线经1:12稀释进行测试。在先天性乏FVIII血浆（Helena）中制备的低浓度曲线经1：5稀释后测试。使用线性lin-lin回归一式两份进行校准。临床样品一式三份，以3种稀释度进行测试（在Coatest?FVIII缓冲液中以1:12、1:24和1:48进行高浓度曲线测试；在先天性FVIII缺陷血浆中以1:5、1:10和1:20进行低浓度曲线测试）。除≤0.IU/mL的样品（其稀释结果最少）外，至少需要在平均值的±15%范围内进行两次稀释并检测。BDDFVIII-SQ酶联免疫分析将待测样品以样品稀释液1:50稀释并添加到以抗体（GMA-，GreenMountain）包被并封闭的ELISA板中。经孵育后，加入生物素化的检测抗体（GMA-，GreenMountain），然后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶，3,3,5,5-四甲基联苯胺底物和酸性终止液。在nm波长处测量吸光度。使用ReFacto?AF/Xyntha?（Pfizer/Wyeth）在乏FVIII血浆（GeorgeKing）中稀释制备具有4个固定点的10点标准曲线（定量范围：4.7ng/mL-80.8ng/mL），并使用4-参数逻辑拟合进行回归分析。样品以复孔进行测试；高于80.8ng/mL的样品需要稀释并重新检测。凝血酶生成试验（TGA）将荧光凝血酶底物，MP试剂（Stago）和pM重组FIXa（HaematologicTechnologies）添加到样品中。在FluoroskanAscent?（Thermo）上于37°C检测凝血酶切割后的底物，并通过连续的单点校准来校正α2M-凝血酶和机内滤器对结果的影响。使用Thrombinoscope?软件（Stago）收集数据。FIXa动力学研究普通血浆参比样品由CRYOcheck?NRP（Precision）标准品加入到乏FVIII血浆（Siemens）中制成。稀释样品（50mM咪唑[pH7.3]，mMNaCl，1%[w/v]BSA），与FVIII缺失的血浆混合，在37°C（Micro-Hywel）中孵育7-8分钟，随后添加APTT（ActinFSL；Siemens）。2.5分钟后，收集t0时间点子样本。3分钟后，加入CaCl2，并大约每8-9秒立即将子样品收集到等体积的冰冷的FIXa终止溶液中[13]。将等分试样在-70°C冷冻，用于FXa和FIIa定量。剩余的子样品用于FIXa定量（ROXFIX-A试剂盒，Rossix）。子样品在预冷的缓冲液中稀释，并加入预冷的微孔板中。将板在37°C下温热3分钟，然后添加试剂1和试剂2。在37°C下温育4分钟之后，添加FXa底物（S-）1-3分钟，然后添加2%柠檬酸溶液终止反应。在ThermoMax（MolecularDevices）分光光度仪上以nm波长测量吸光度。FXa和FIIa动力学研究FXa和FIIa的反应动力学实验方法与前述FIXa动力学实验相同。终止子样本中的FXa使用凝血酶原酶复合方法定量，该方法可测量FXa介导的FIIa（凝血酶）形成。简而言之，将子样本或人FXa校准品（EnzymeResearch）在37°C下孵育3分钟，然后加入人FII（Rossix）、牛FVa（Rossix）、磷脂-TGT（Rossix）和CaCl2。在37°C温育期间，凝血酶原酶（FXa+FVa）催化FII（凝血酶原）转化为FIIa（凝血酶），通过使用FIIa底物S-（HD-Phe-Pip-Arg-pNA，Chromogenix）进行定量。37°C下孵育6分钟后，以2%柠檬酸终止底物水解。分光光度仪ThermoMax上以nm波长测量吸光度。另外，使用S-的直接水解对原始子样品中的凝血酶进行定量，并在37°C下温育2小时后以2%柠檬酸终止反应。图1.OS和CS检测中FVIII活性的相关性。使用线性回归将BMN临床试验-（A）、-（B）和20个健康对照者（C）中OS和CS检测中的FVIII活性数据相关联。每个数据点代表一次随访的FVIII活性数据；同一受试者的多次随访数据用相同的彩色符号表示。回归曲线的斜率反映了OS和CS活性检测之间的恒定变化率。OS和CS检测FVIII活性的统计分析使用SAS（版本9.4）生成基线后，对匹配的OS/CS测得的FVIII活性进行线性回归分析。如果样本是在最后一次FVIII输注后的72小时或3日内，或者测定值低于检测下限（belowthelimitofquantification,BLQ），则数据被排除。去除统计异常值（student检验斜率参数2，或DFBETAS统计值2）。对于健康献血员，y截距被抑制；在没有抑制的情况下，y截距为9.，斜率为0.，R2为0.。FVIII比活性的统计分析将扣除基线后的FVIII活性标准化为对应的FVIII-SQ蛋白量。计算组间和组内平均值、标准差或置信区间。如果样本在最后一次FVIII输注后的72小时或3日内获得，则数据不纳入统计；BLQ活性估算为0IU/dL。OS和CS分析中至少没有一项可定量比活性结果的检测样本被排除在统计之外。关节出血频率和FVIII活性测量值的统计分析使用SAS分析软件以负二项式回归设置基线，以每4周为时间间隔统计受试者在治疗后的关节出血和血浆中位FVIII活性。以95%为置信区间预测相应FVIII水平的联合出血频率。同样也以广义预测函数分析相关数据。如果样本在最后一次FVIII输注后的72小时或3日内获得，则数据不纳入统计；基准BLQ活性设为0IU/dL。结果转基因FVIII-SQ的OS活性高于CS活性为了比较首次基因治疗试验-中BMN转基因FVIII-SQ的OS活性和CS活性，我们利用队列3（剂量：6E13vg/kg）累积了3年的数据和队列4（剂量：4E13vg/kg）累积了2年的数据[4]扩展了此前1年的分析数据[1]。通过回归的OS/CS比值斜率（图1A）推算，OS和CS活性之间的比值为1.（R2=0.）。对关键试验-（剂量：6E13vg/kg）中期的FVIII活性数据进行线性回归分析后我们得到了相似的结果，其中OS/CS比值为1.（R2=0.）（图1B）。相反，在20个健康对照中FVIII活性的线性回归显示OS/CS比值为1.（R2=0.99）（图1C）。此外，应用混合的正常血浆（补充图2）和WHO标准（补充表1）对两种检测中FVIII活性的差异进行量化。我们观察到仅转基因FVIII-SQ的OS活性持续高于CS活性。检测试剂或试剂盒对OS/CS差异无明显影响我们对两种检测中应用的各种试剂（补充图3-5）进行了研究，均无法解释转基因FVIII-SQ的OS活性更高的原因。如同预期一样，重组BDD-FVIII（Xyntha?/ReFacto?和Novoeight?）的OS活性低于CS活性（补充图6）[2,6,15]。为进一步研究各种OS和CS检测试剂盒的潜在影响，同时考虑到不同检测实验室的特异性差异，我们在试验-（补充表2）和-（补充表3）中对13个不同的检测实验室进行了一项回顾性研究。当地实验室的OS试剂盒使用了7种不同的APTT试剂，其中包含合成的、动物性或植物性磷脂和3种不同类型的表面活化剂（鞣酸、二氧化硅或高岭土）。此外，我们选择了6种不同的CS试剂盒，其中包含人或牛FIXa/FX试剂，并使用了4种不同的发色FXa底物。这两项实验中，我们利用FVIII活性的线性回归分析了1,多份独立样本并确定了每个实验室中基因治疗样本的OS/CS比值，其波动于1.-2.之间（补充表2、3）。因此，转基因FVIII-SQ的OS活性始终高于CS活性与检测试剂、试剂盒及检测地点无关。不同实验室间OS/CS差异一致的幅度和方向性表明，其潜在机制为转基因FVIII-SQ所固有，而非任何特定检测试剂盒或检测设备的人为因素。图2.重组和转基因产生的FVIII-SQ的比活性。将重组FVIII-SQ（Xyntha?）掺入来自重度HA个体的血浆中，以使用OS或CS分析（A、B）测定比活性（IU/mg）。使用OS或CS分析（C、D）确定来自BMN临床试验-的个体受试者中转基因产生的FVIII-SQ的平均比活性。使用OS或CS分析（E、F）确定来自BMN临床试验-的个体受试者中转基因产生的FVIII-SQ的平均比活性。A、C和E中的虚线表示Xyntha?（5,-9,IU/mg）中比活性的规格范围。B、D和F中的虚线表示ReFacto?（7,-13,IU/mg）中比活性的规格范围。鉴于重组FVIII-SQ的OS低于CS活性，因此规格范围取决于用于产品标记的检测方法（Xyntha?为OS；ReFacto?为CS）。C-F中的误差线代表受试者内部标准偏差。转基因FVIII-SQ和重组FVIII-SQ的比活性在CS检测中一致为了测定FVIII的比活性，我们在经过验证的FVIII-SQ蛋白ELISA中检测了具有已知OS和CS活性的基因治疗样本。应用OS和CS检测（图2A、2B），我们首先证实了添加Xyntha?的HA血浆中重组FVIII-SQ产品[6,16]可表现出预期的比活性。使用OS检测法测定个体基因治疗患者中转基因FVIII-SQ的比活性，其结果在试验-（图2C）中波动于18,-24,IU/mg之间，在试验-中波动于13,-34,IU/mg（图2E）之间，受试者间的平均水平分别为20,IU/mg和21,IU/mg。这些数据比OS检测中重组FVIII-SQ产品的比活性上限高2倍以上[16]。相反，使用CS检测法测定个体基因治疗患者中转基因FVIII-SQ的比活性，其结果在试验-（图2D）中波动于10,-14,IU/mg之间，在试验-（图2F）中波动于6,-19,IU/mg之间，受试者的平均水平分别为12,IU/mg和分别为13,IU/mg。这些数据基本与CS检测中重组FVIII-SQ产品的比活性一致[6]。值得注意的是，试验-（两种检测）中受试者间的FVIII比活性的可变性明显更高，我们推测这很可能与该研究中受试者人数更多有关。表1.重组FVIII-SQ的OS和CS活性检测差异a根据参考文献[19]。b与BMN中的密码子优化相同。C推算数值高于检测上限，但稀释后测试样品的原始数据在测量范围内。序列多态性、宿主细胞类型和密码子优化对OS/CS检测差异的影响由于天然多态性，Xyntha?/ReFacto?序列与BMN编码的共有序列相差一个氨基酸[17,18]。为确定这种多态性（PheLeu）是否影响FVIII-SQ活性的检测，我们在中国仓鼠卵巢（ChineseHamsterOvary,CHO）细胞表达了FVIII-SQLeu（ReFacto-like）或FVIII-SQPhe（BMN-like）。我们对上述突变蛋白检测后发现其OS/CS活性一致或OS活性低于CS活性（表1，第一行）。因此，单核苷酸多态性无法解释重组FVIII-SQ产品OS活性低于CS活性的原因。此外CHO细胞中的BMN-样FVIII-SQPhe的OS活性降低，这表明宿主细胞可能存在影响。Xyntha?/ReFacto?是在CHO细胞中生成的[19]，而基因治疗的FVIII-SQ由人体肝细胞产生。为了直接研究宿主细胞类型是否影响FVIII-SQ的检测结果，我们对转导人肝癌细胞（HepG2）后表达的FVIII-SQ进行检测发现其OS活性高于CS活性，这与患者血浆中转基因FVIII-SQ相似，而CHO来源的Xyntha?的OS活性更低（表1，中间行）。因此，宿主细胞的物种特异性机制可能会导致重组和转基因FVIII-SQ在OS检测中存在差异。BMN经密码子优化以促进其在人体细胞中的高效翻译，这可能影响FVIII-SQ的折叠，从而对稳定性、蛋白酶敏感性和功能产生潜在影响[20,21]。为了测定密码子优化是否影响OS/CS的检测差异，FVIII-SQ分别通过密码子优化和非密码子优化的载体表达于HepG2细胞中。对两种载体（表1，底行）表达的FVIII-SQ检测后发现OS活性均高于CS活性。为了排除潜在的组织特异性差异，用密码子优化的载体转染人类胚胎肾（humanembryonickidney,HEK）细胞，结果显示FVIII-SQ的OS活性同样高于CS活性。因此，在人体细胞中表达的FVIII-SQ的OS活性高于CS活性并非是密码子优化或肝脏特异性修饰的结果。动力学研究表明凝血早期的FXa和凝血酶生成加速在先前的研究中我们发现转基因FVIII-SQ和天然FVIII在CS检测中具有相似的FXa动力学[1]。为了研究OS检测中的反应动力学，在反应终止后将两名基因治疗患者的血浆与正常血浆进行比较。该比较在CS活性相同的前提下进行，以识别OS和CS检测之间的潜在动力学偏差。这些样本经APTT试剂孵育；加入CaCl2后收集子样本并对FIXa、FXa和FIIa（凝血酶）进行定量。基因治疗样本和正常血浆的FIXa生成动力学曲线并无差异（图3A、3B），然而基因治疗样本的FXa（图3C、3D）和凝血酶（图3E、3F）生成在加入CaCl2后的40-60秒间升高，这表明血栓形成加快。因此，在OS检测的第一分钟内，转基因FVIII-SQ的FXa水平高于CS检测。由于CS活性依赖于5分钟后产生的FXa水平，故可表明相比于天然FVIII，转基因FVIII-SQ选择性地在凝血过程的早期和晚期加速了FXa的产生。因此，OS和CS检测的动力学偏差可以解释为何基因治疗样本在为时较短的OS检测中FVIII活性更高。图3.OS检测中FIXa，FXa和FIIa形成的动力学。在OS停止动力学实验中，比较了从BMN治疗的2个不同受试者中收集的含有转基因产生的FVIII-SQ（基因治疗血浆）的血浆样品和具有相同CS活性的含有天然FVIII（正常血浆，稀释液）的血浆样品。加入CaCl2后60秒内监测FIXa产生（A、B），FXa产生（C、D）和FIIa（凝血酶）产生（E、F）。误差线代表重复评估之间的标准偏差。图4.FIXa触发的凝血酶生成测定。自个体受试者（n=7）在23-26周之内达到非血友病CS的活性水平（≥40IU/dL）后，健康对照者样品（正常血浆，n=40）中的天然FVIII和试验-（基因治疗血浆，n=25）中转基因产生的FVIII-SQ进行了比较。针对凝血酶峰值（A）、ETP（B）、滞后时间（C）和峰值时间（D）生成了箱线图。方框中的水平线表示中位数，方框表示Q1-Q3四分位数间距（IQR），而上下边缘表示分别位于Q1-1.5xIQR和Q3+1.5xIQR内的最小值和最大值。虚线水平线分别代表正常参考范围的下限和上限。P值代表Mood’s中位数检验得出的显著性水平。为了证明加速凝血启动不会导致其总体过度活化，我们进行了凝血酶生成测定（thrombingenerationassay,TGA）。本研究中，我们选择经基因治疗后FVIII活性达到正常（CS≥40IU/dL）的血友病患者血浆与正常血浆进行对比，发现其内源凝血酶电位（endogenousthrombinpotential,ETP）和峰高相似，与正常总凝血酶水平相符（图4）。尽管凝血酶滞后时间和峰值时间的中位值降低，但仍保持在正常范围内，因此我们证实了凝血酶的形成存在轻度加速。关节出血频率与FVIII活性之间的相关性为了确定OS和CS检测是否与临床预后相关，利用基因治疗试验-（图5A）和-（图5B）的数据，以4周为时间间隔对患者提供的治疗后关节出血情况与FVIII活性中位值进行相关性分析。两项试验中，由35例患者提供的大多数关节出血情况（42/43例）发生在FVIII活性中位值低于15IU/dL（OS）和低于等于10IU/dL（CS）时。采用负二项回归模型，两项试验的OS和CS活性均与预测的关节出血频率密切相关（P值≤0.）（图5A、B）。然而，我们发现OS活性的回归曲线比CS活性偏右侧，该特征在FVIII活性15IU/dL时尤为显著。这意味着当FVIII-SQ活性数值相同时，OS检测相对于CS检测预测的出血风险更高。考虑到95%的置信区间（confidenceintervals,CI），因此这一趋势仍需更多的临床数据来证实。当FVIII活性中位数为40IU/dL或更高时[22]，两种检测方法预测的关节出血频率均接近于零（在CS中每4周0.，在0S中每4周0.）。因此，OS和CS检测在评判经BMN基因治疗后的血友病及非血友病FVIII活性水平时仍然具有临床意义。讨论我们研究了BMN基因治疗后转基因产生的FVIII-SQ的活性，结果表明，OS比CS活性更高的原因可能是OS中FXa的和凝血酶生成速度更快所致（图3）。由于CS检测时间较短，因此时间因素主要影响OS检测（图6）。TGA实验未提供基因治疗可能增加血栓形成风险的证据，因为ETP和凝血酶峰值均未升高（图4）[23-25]。此外，转基因产生的FVIII-SQ和重组FVIII-SQ的比活性（IU/mg）（ReFacto?/Xyntha?）在CS检测中相对一致，但在OS检测中却没有可比性（图2）。因此我们认为，采用CS活性检测方法，任何浓度的转基因产生的FVIII-SQ蛋白都能与输注重组FVIII-SQ发挥相似的效用（参见图7）。转基因产生的FVIII-SQ和重组FVIII-SQ的不同OS活性可以通过人类和非人类细胞之间的差异来解释（表1）。正在开展中的一些研究显示，这可能是由于两者在翻译后修饰[26]或蛋白质折叠过程中存在差异。但值得注意的是，某些同样在人细胞，比如人HEK细胞中生产的重组产物，例如Fc融合（Eloctate?）或未修饰（Nuwiq?）的BDD-FVIII，其OS活性也低于CS活性[4,27,28]。Fc融合的BDD-FVIII，OS比CS活性低是由于从FVIII从其配体vonWillebrand因子（vonWillebrandfactor,VWF）的延迟释放引起的[29]。因此，某些修饰剂（例如，在冻干过程中加入的辅料）可能会在检测中影响重组产品的活性。图5.关节出血频率与FVIII活性水平的相关性。对于每个受试者，在BMN临床试验-（A）和-（B）中，使用OS（蓝色圆圈）或CS（红色圆圈）测量的每4周间隔内治疗的关节出血数量与每个间隔内的FVIII活性的中值相关。通过OS活性（蓝色实线）和CS活性（红色虚线）的负二项式回归对每4周间隔的预测出血频率进行建模。带阴影的彩色区域表示相应的95%CI。两种测定均未报告FVIII活性50IU/dL的关节出血；尽管这些数据已包含在建模中，但此处未显示。尽管转基因产生的FVIII-SQ的活性测量结果存在差异，但OS和CS检测对于评估BMN基因治疗后的血友病和非血友病FVIII活性仍然具有临床意义（图5）。FVIII活性水平与出血率之间的相关性在我们的研究中受到一定程度的限制，因为患者治疗后自发性出血通常很少见，并且由于该数据由参试者会自行报告，因此容易出现一定程度的主观性。尽管如此，在两种测定中，当FVIII活性中值≥40IU/dL时均不存在关节出血，这与WHO对HA的描述相符[22]。这些数据也与接受重组产品进行三级预防治疗的严重HA患者的报道一致：FVIII活性在40IU/dL时，无自发性关节出血的患者比例为%（95%CI：94.25%-%）[30]。图6.导致比转基因生产的FVIII-SQ的CS活性更高的OS的动力学偏差的说明。与天然FVIII相比，转基因生产的FVIII-SQ可以加快早期FXa的形成，从而导致FXa浓度（pM范围）略有增加。这会使OS检测中凝血酶活化和血凝块形成更快，可以解释OS有着更高的测量值，因为该分析在凝血反应的前1至2分钟内使用了动力学终点（达到可见凝块的时间）。相反，CS分析使用更多的稀释测试样品，并在5分钟这样更长的固定孵育时间后确定FXa浓度。在这一点上，FXa的产生已被指数级放大（nM范围），并且大概率不会受反应早期发生的微小差异的影响。因此，测定读数的不同时间会导致OS和CS测定之间出现动力学偏差，从而时间较短的检测（OS）会出现较高的FVIII活性值。pM，皮摩尔（pmol/L）；nM，纳摩尔（nmol/L）。从结果来看，转基因产生的FVIII-SQ对自发性出血的保护作用似乎能够长期维持，即较低的FVIII水平也是如此（图5）。两种检测方法均判断当FVIII活性≥15IU/dL时出血风险可忽略不计，这与迄今为止的文献和临床经验一致[31,32]。然而，在15IU/dL的水平下，与CS检测相比，OS检测结果会指示更高的关节出血频率。因此，临床实践中应仔细观察临床表型，以评估在严重（1IU/dL）、中度（1-5IU/dL）和轻度（5-40IU/dL）HA条件下，转基因产生的FVIII-SQ活性与出血风险的一致性[22,31-34]。可以想象，在OS中能检测到的由体外转基因产生的FVIII-SQ推动的FXa在体内同样可以促进凝血，即使在较低水平。尽管如此，在BMN临床研究过程中，我们仍建议选择CS活性作为替代终点，以确保最保守的止血效果评估。此外，考虑到不同产品在CS检测中的FVIII活性比较一致，使用CS活性可实现AAV基因治疗与当前血友病标准诊疗之间的直接可比性。在使用BDD-FVIII[35]的血友病A和使用FIX-Padua（FIXRL）的血友病B中，基于AAV的基因疗法也存在OS高于CS值的测定差异[36]。Padua突变会增加FIX的比活性，从而引起反应动力学的改变，与OS检测中凝血反应加速有关的因素也可能对FIX-Padua起作用。AAV基因疗法之间更普遍的共性可能是大家都使用了密码子优化的载体。在极少数情况下，密码子优化会影响蛋白质折叠和生物学活性[20,21]；然而，本文的研究表明，密码子优化并不是导致人肝细胞系FVIII-SQ的OS活性高于CS活性的原因。今后研究FIX[37]和FIX-Padua[36]的密码子优化是很有价值的。肝内定向输注AAV-FVIII基因疗法的另一个需要考虑的因素是，FVIII在肝细胞中属于异位表达，因为天然FVIII主要在各种类型的内皮细胞（包括肝窦细胞）中产生[38,39]。虽然我们的研究排除了FVIII-SQ的OS活性高于CS活性是肝脏特有的现象（表1），但内皮细胞修饰或分泌FVIII的方式确实可能不同于肝细胞。需要更多的研究工作来了解不同人类细胞中细胞内和细胞外FVIII加工的分子差异，包括翻译后修饰。值得注意的是，这种机制不适用于针对肝脏的AAV-FIX基因疗法的检测差异，因为天然FIX也在肝细胞中产生[40]。既往使用血浆来源的FVIII标准品校准测定样品中的FVIII活性时，OS和CS检测的结果高度一致[41]。然而，随着重组FVIII产品的出现，两者的分析差异开始出现，通常OS检测值比CS活性低[2-4,27,42]。对于具有长半衰期（extendedhalf-life,EHL）的新型重组FVIII/FIX产品，两种检测方法的差异也很常见[43-45]。一般来说，EHL-FVIII产品的OS/CS检测差异相当有限，并不影响其效价估算，但不同的APTT试剂可能产生不同的结果[28,46-50]。对于EHL-FIX产品，OS/CS分析差异可能非常明显[13,51-54]。正是因为这些差异使得业界对于标注重组FVIII/FIX产品效价提出了指导性建议[55]。这些分析差异背后的一个根本原因可能是相似性原理产生的偏差，即非天然FVIII/FIX分析物与天然FVIII/FIX标准品之间的分子差异，导致测定中的行为差异。这在生化机制上得到了某些非天然FIX产品的证实[13,56]。这些研究表明，在OS检测中，由于其检测时间较短，可能比在CS检测中更容易出现偏离对照的情况。本文报道的基因治疗衍生FVIII-SQ的研究结果似乎证实了OS检测方法的这种脆弱性，并证实了CS检测在非天然FVIII分析物临床监测中的应用价值。在只有OS检测可用的实验室中，可以为基因治疗样本建立一个经过彻底评估的实验室特定的OS/CS转换参数，以得出对应的CS检测活性。致谢AcknowledgmentsTheauthorsthankChristopherTudanandKrystalSandzaforvalidationoftheBDDFVIII-SQELISA;SteveMcBryantforvalidationoftheTGA;AlexGiaramita,VishalAgrawal,MelanieLo,andLucyCrockettforre