概述
血友病基因治疗的研究方向就是在提高凝血因子水平的同时降低风险。TAK-是新一代的腺相关病毒，通过该项针对小鼠和恒河猴的研究证实，TAK-在提高凝血因子IX活性的同时，可以降低免疫原性并促进肝脏特异性FIX基因转移。
研究背景
腺相关病毒（AAV）为载体的基因治疗方法具有改善凝血因子IX（FIX）缺乏并治疗血友病B患者的潜力。
TAK-（以前名为SHP；武田公司BaxaltaUSInc.，美国马萨诸塞州列克星敦市）是一种新一代AAV载体，旨在将F9（FIX）基因转移到肝脏。
该单链载体是用去胞嘧啶磷酸鸟苷（CpG）的FIXRL“Padua”转基因，从而最大程度地降低免疫原性。
TAK-还包括3种肝细胞特异性顺式调控元件（CRM8）来增强肝脏特异性FIX表达，通过增加肝脏特异性甲状腺素启动子的强度来驱动人类FIXPadua转基因表达（图1）。
图1.二代FIX基因治疗载体TAK-的设计
研究目的
研究TAK-对FIX活性的剂量反应关系，并评估其在FIX基因敲除（ko）小鼠和恒河猴中的疗效。
研究方法
TAK-在FIXko小鼠中的药理作用
所有动物实验均已获得国家有关机构和单位动物护理和使用委员会的批准。雄性FIXko小鼠（N=12/组）接受单剂量的TAK-静脉注射（7.4×101o、1.5×1011、7.4×1011或1.5×1012载体基因组[vg]/kg）或缓冲液。
在第7、14、28、42和56天收集血液样本以分析血浆FIX活性。在观察期结束时，通过尾尖出血测定法评估出血表型。
通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析了肝组织中的病毒转导效率（图2）。
图2.FIXko小鼠体内TAK-表达的药理学评估安全性评估包括监测临床体征以及对选定器官（肝，脾，肾和心脏；未展示结果）进行组织病理学分析。
TAK-在恒河猴中的药理作用
雄性恒河猴（N=3/组）接受单剂量的TAK-静脉注射（3.8×1011、9.5×1011或1.9×1012vg/kg）。
在注射前采血，注射后每周采血一直到18周。
-检测血浆FIX活性、人FIX抗原和抗人FIXPadua中和抗体。（图3）图3.恒河猴体内TAK-表达的药理学评估
研究结果
TAK-在FIXko小鼠中的药理作用
所有用TAK-治疗的FIXko小鼠均在生命期内存活，没有任何临床症状。
TAK-以剂量依赖性方式增加FIXko小鼠体内的平均FIX活性，从低于测定检出下限的水平到超生理水平（41.0IU/mL）（图4）（P0.05vs.缓冲液对照）。
图4.通过一期法凝血测定检测人FIX活性
在鼠尾采血法中（图5），TAK-≥1.5×1011vg/kg的剂量与缓冲液对照组相比明显减少了失血量（P0.05）。
图5.鼠尾采血法检测出血倾向
TAK-介导的肝脏定向转导通过在TAK-处理的FIXko小鼠肝组织中人FIXDNA的检测（图6）和人FIX蛋白免疫组化检测（图7）来证实。
图6.qPCR方法检测肝脏DNA
图7.免疫组化检测肝脏FIX表达
TAK-在恒河猴中的药理作用
所有恒河猴均在预期的生命阶段中存活，没有任何TAK-相关的临床体征。
TAK-剂量依赖性增加平均血浆FIX活性（图8）和人FIX抗原水平（数据未展示）。
–除最低剂量组中1只外，所有动物均已证实人FIX的表达。图8.一期法凝血测定及Bethesda法检测恒河猴体内FIX活性
在TAK-给药后约4周开始，在大多数动物中都检测到FIX活性和人FIX抗原水平的显著降低。
在TAK-给药后约6周，在大多数动物中检测到抗人FIXPadua中和抗体（NAbs），与先前人FIX表达的降低有关（图9）。
图9.抗-huFIX中和性抗体检测
结论
TAK-是第二代F9（FIX）基因治疗AAV载体，旨在最大程度降低免疫原性并促进肝脏特异性FIX基因转移。
在这项研究中，TAK-可以显著减少FIXko小鼠的出血，并剂量依赖性地增加FIXko小鼠和恒河猴的血浆FIX活性。
动物模型中的所有安全性评估均未发现与治疗相关的事件。
参考文献：
MarkusWeiller,etal.EvaluationoftheHumanFactorIXGeneTherapyVectorTAK-inHemophilia:ResultsFromNon-ClinicalStudiesinFactorIXKnockoutMiceandRhesusMonkeys.ASHPoster.
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